一、 貼壁細(xì)胞傳代（以一個T25瓶為例）

1、 吸出原培養(yǎng)液；

2、 加入2ml左右PBS，輕輕晃動培養(yǎng)瓶潤洗細(xì)胞，吸出PBS丟棄；

3、 加入1ml左右胰酶，輕輕晃動培養(yǎng)瓶使之浸潤所有細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱消化；

4、 消化時間跟據(jù)細(xì)胞特性有所不同，顯微鏡下看到細(xì)胞塊中間的細(xì)胞明顯分離變圓，側(cè)立培養(yǎng)瓶細(xì)胞可以滑落時可終止消化，全程不要拍打培養(yǎng)瓶；

5、 加入3ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞使之脫落并在液體里反復(fù)吹打使細(xì)胞，使之盡量呈單顆細(xì)胞的懸浮液，這時可以在顯微鏡看下；

6、 收集細(xì)胞懸液離心，1200rpm（約250g） 3分鐘，離心完吸出上清丟棄。

7、 加入新鮮培養(yǎng)基，吹打幾下混勻細(xì)胞即可，按需接種到新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)基，擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進(jìn)行培養(yǎng)。

8、 檢查培養(yǎng)箱二氧化碳，溫度和水盤。

二、 懸浮細(xì)胞傳代（以一個T25瓶為例）

1、 輕輕吹散懸浮細(xì)胞，部分貼壁松散的懸浮細(xì)胞可直接吹打培養(yǎng)瓶底部使細(xì)胞懸浮，收集細(xì)胞懸液到無菌離心管中，離心1200rpm（約250g） 3分鐘，離心完畢吸出上清丟棄;

2、 加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按比例接種至培養(yǎng)瓶（接種比例按實(shí)際情況，不確定可計(jì)數(shù)后再接種）;

3、 常規(guī)細(xì)胞推薦以3~5×105cells/ml傳代，長到2×106cells/ml傳出;

4、 建議剛開始幾代計(jì)數(shù)后傳代，后面可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)按比例傳代。

三、 半貼壁半懸浮細(xì)胞傳代（以一個T25瓶為例）

1、 培養(yǎng)液（含懸浮的細(xì)胞）：用移液器吸出培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中；

2、 貼壁部分：用1ml PBS洗細(xì)胞，吸出PBS放入到第1步裝有培養(yǎng)液的離心管中收集（不要直接丟棄，里面有細(xì)胞）；

3、 培養(yǎng)瓶加入胰酶1ml，放入培養(yǎng)箱靜置消化；

4、 消化時間跟據(jù)細(xì)胞特性有所不同，顯微鏡下看到細(xì)胞明顯收縮變圓，側(cè)立培養(yǎng)瓶細(xì)胞可以滑落時可終止消化，全程不要拍打培養(yǎng)瓶；

5、 用3ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，將消化下來的細(xì)胞懸液吹散細(xì)胞后收集到第1步的離心管；

6、 將離心管在1200rpm（約250g） 3min離心，離心完畢棄掉上清，加入新的培養(yǎng)基重懸，按實(shí)際情況分瓶，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

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