1、固相載體選擇

聚苯乙烯：具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。

聚氯乙烯：聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。

2、包被

①板孔的選擇：ELISA級別的微孔板

②抗體選擇：選擇支持ELISA實驗的抗體，根據推薦濃度稀釋或摸索最適濃度

③包被緩沖液：pH9.6碳酸鹽緩沖液或pH7.2磷酸鹽緩沖液

④包被溫度：2-8 ℃過夜包被或室溫（37℃）包被2h

⑤包被濃度：包被濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化。一般包被濃度為10ug/ml-20ug/ml。

3、封閉

①包被之后一定要立即封閉（封閉非特異性抗體）

②選擇效果較好的封閉劑（細胞培養(yǎng)級BSA、Tween等）

4、加樣及孵育

①加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。

②孵育的時間及溫度參考試劑盒說明書。如有條件，建議加樣孵育時使用shaker震蕩儀，推薦軌道直徑3mm，轉速在500±50rpm；

③檢測抗體、酶標物的稀釋比例、孵育溫度、孵育時間嚴格根據說明書提示；

④洗板對于ELISA來說，是極其關鍵的一步，保證ELISA的特異性

⑤封板膜一定要一次一換，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染

5、顯色和終止

①使用前需檢查，底物在加入96孔板之前應為無色透明

②顯色底物需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免污染

③孵育時間，說明書上為參考范圍，但具體需要根據實驗條件自行摸索。