基本實驗步驟：

（1） 細胞準備。對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

（2） 固定。根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎９潭ㄍ戤吅蟮募毎芍糜诤B氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min.

（3） 通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.

（4） 封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min.

（5） 一抗結(jié)合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.

（6） 二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。

（7） 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

（一）細胞準備

用于免疫熒光實驗的細胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細胞，也可以是經(jīng)過離心后涂片的懸浮細胞或者是將取自體內(nèi)的組織細胞懸液離心后涂片。貼壁良好的細胞一般在培養(yǎng)時直接放入coverslips讓細胞生長在其上即可，盡量避免使用貼壁性能不好的細胞進行免疫熒光實驗，以免后續(xù)的漂洗操作引起細胞脫落。少數(shù)實驗需要使用這類細胞或者懸浮細胞進行免疫熒光觀察，建議使用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

（二）固定和通透

除研究細胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外，一般均應固定。固定的目的有三：

①防止細胞從玻片上脫落；

②除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂；

③使標本易于保存。

標本的固定原則是：

①不能損傷細胞內(nèi)的抗原；

②不能凝集蛋白質(zhì)；

③應保持細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)；

④固定后應保持通透性，以保證抗體自由進入所有細胞與亞細胞組分與抗原結(jié)合。